Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур 8
2.2. Структура коллагеновых фибрилл 11
2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели 12
2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл 12
2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл 15
2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo 19
2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, рН, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса 29
2.5.1. Состав ионов 31
2.5.2. Ионная сила 32
2.5.4. Температура 32
2.5.5. Концентрация 36
2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса 37
2.5.6.1. Гликозаминогликаны 38
2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей 42
2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл 44
2.7.1. Метод электронной микроскопии 44
2.7.2. Метод рентгеновской днффракции 46
2.7.3. Метод поляризационной микроскопии 48
2.8. Метод калориметрии 49
3. Материалы и методы исследования. .54
3.1. Материалы и реактивы 54
3.1.1. Объекты исследования. 54
3.1.2. Реактивы.. 54
3.2. Выделение коллагена и очистка 54
3.2.1. Коллаген из кожи свиней 55
3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 55
3.2.2.1. Коллаген с телопептидами 55
3.2.2.2. Коллаген без телопептидов. 57
3.3. Методы исследования 57
3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов 57
3.3.2. Определение концентрации коллагена 58
3,З.З.Оптические методы 58
3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия 58
3.3.3.2. Спектрофотометрия 58
3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия 59
3.3.4, Метод сканирующей калориметрии 60
3.3.5. Методы электронной микроскопии 61
3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии 61
3.3.5.2. Метод негативного контрастирования 61
3.4. Формирование коллагеновых фибрилл 62
3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул 62
3.4.2.0птимизация начальных условий фибриллогенеза коллагена w 63
3.4.2.1.Выбор методов образования нативных коллагеновых фибрилл 63
3.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4С с изменением температуры до 25С, 30С, 35С 65
3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса 65
3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров. 65
4. Результаты и их обсуждение 68
4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I с удаленными телопептидами 68
4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл 72
4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул. 75
4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий 83
Заключение.89
Введение к работе
Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагена -проколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.
Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.
Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.
Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.
6 Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.
Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.
Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа І в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:
Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.
Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.
Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.
Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура коллагеновых фибрилл
Для строения фибрилл характерно ступенчатое расположение молекул со сдвигом на четверть их длины (рис,2). Расположенные в один ряд молекулы не связаны N- и С-концами. Между концом одной молекулы и началом следующей существует промежуток, размером - 40 нм. На электронно-микроскопических снимках наблюдается чередование светлых и темных полос, где светлой полосе соответствует область перекрывания молекул (overlap -зона), а темной полосе - область с промежутками между молекулами (gap -зона). Коллагеновые фибриллы по данным рентгеновской диффракции и электронной микроскопии имеют период поперечной исчерченности D, равный 64-67 нм. Анализ аминокислотных последовательностей полипептидных цепей выявил, что D-периоду соответствует группировка аминокислот в блоки по 234 аминокислотных остатка на а-цепь (Hulmes, 1973; Fraser, MacRae, 1987). В молекуле коллагена четыре таких последовательно расположенных блока. Пятый, С-концевой участок тройной спирали, имеет размер 0,4D и состоит из 90 аминокислотных остатка. На С-участке одной молекулы и перекрывающего его такого же размера N- концевом участке другой молекулы в связывании молекул участвуют глобулярные N- и С- телопептиды (Scott, Orford, 1981; Vitalgiano et al., 1995). Телопептиды составляют 2% от молекулярного веса коллагена, тем не менее они существенно влияют на структуру фибрилл. Включение телопептидов в поперечное связывание молекул способствует не только образованию прочных фибрилл, но и сохраняет им гибкость. В этих участках молекул происходит образование ко валентных связей между тройной спиралью и концевыми телопептидами. 2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели. 2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл. В отличие от многих фибриллярных белков образование коллагеновых фибрилл происходит при одновременном росте молекул в продольном и поперечном направлении. Связывание молекул регулируется распределением вдоль пептидной цепи специфично взаимодействующих аминокислотных остатков. Связи образуются как между глобулярными телопептидами и тройными спиралями, так и между тройными спиралями коллагена. Для спираль-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на D-период (Ward et al, 1986). D-участок в молекуле коллагена образован в основном гидрофобными и полярными аминокислотными остатками. Гидрофобные аминокислоты имеют более четкий период распределения, чем полярные. D-период является максимумом для гидрофобных контактов при связывании молекул в фибриллы. Гидрофобные взаимодействия минимизируют поверхность коллагеновых молекул, доступную для молекул воды (Wallace, 1985). Последовательный сдвиг молекул коллагена на D-период дает достаточно большой участок (-200 нм) для взаимодействий между соседними молекулами.
Поэтому связывание в длину имеет большие преимущества. Для телопептид-спиральных взаимодействий оптимальным является сдвиг молекул на 4 D (Helseth et al, 1979). В работе (Veis, George, 1994) установлено, что смещение двух молекул на период 4 D связано с максимизацией электростатических взаимодействий в фибриллах. Определено, что максимальные величины положительных и отрицательных зарядов в молекуле локализованы на концах тройной спирали. В молекуле фибриллярного коллагена типа II участки Dl, D4 имеют повышенную стабильность, а участки D2, D3 пониженную стабильность (Arnold et al, 1998). Для коллагена характерна высокая степень упорядоченности в продольном направлении фибрилл - дальнодействующая упорядоченность. Дапьнодействующая упорядоченность регулируется максимизацией электростатических и гидрофобных взаимодействий. В процессах фибриллогенеза электростатические взаимодействия преобладают над гидрофобными, так как в коллагеновых молекулах число заряженных аминокислотных остатков составляет 16 %, а число гидрофобных аминокислотных остатков составляет 6 % (Brodsky et al., 1995). Полярные группы на тройной спирали образованы из аминокислот с чередующимися положительными и отрицательными зарядами. Такое распределение полярных групп приводит к внутримолекулярной нейтрализации зарядов, а также к сильным межмолокулярным контактам. При связывании образуется сеть положительных и отрицательных зарядов, после чего может возрастать отрицательный заряд и энергия связывания между молекулами (Chapman, 1984). Полярные аминокислотные остатки являются гибкими и менее ограничены во взаимодействиях, чем гидрофобные аминокислотные остатки. Полярные группы аминокислотных остатков образуют связи не только между собой, но и с ионами растворов. Известно, что число заряженных групп на тройной спирали коллагена типа I составляет 531(WaIlace, 1990), В то же время разные авторы (Li et al., 1975; Piez, 1982; Silver, 1982) представили данные, что в процессе образования фибрилл связывается 40-150 заряженных аминокислотных остатка. Это свидетельствует, что не все заряженные группы на тройной спирали доступны для взаимодействий между молекулами. Предполагают, что механизм упаковки в продольном направлении включает взаимодействия между необычными блоками заряженных пар, локализованных на тройной спирали коллагена в позиции 53, 54, 56 и 990, 992, а также в неспиральных концах (Silver, 1982). Заряженные пары притягиваются к друг другу либо электростатически, либо в форме гидрофобных кластеров между молекулами. Полярные аминокислотные остатки, вероятно, находятся в протяженной конформации. Так как лизин и аргинин являются наиболее длинными боковыми цепями, возможно, что именно эти аминокислотные остатки притягиваются на начальных этапах образования фибрилл. Перед таким сильным взаимодействием молекулы воды, связанные с этими остатками, должны быть удалены. По-видимому, такой процесс происходит при физиологических температурах. Высокая степень трансляционной симметрии фибрилл по отношению к оси фибрилл, определенная по меридиональным рефлексам под малыми углами, и регулярный D-период указывают на то, что межмолекулярные контакты в продольном направлении особенно предпочтительны.
Это обусловлено комплементарными взаимодействиями между двумя молекулами, а также значительным расстоянием в продольном направлении фибрилл, на протяжении которого распространяется периодический тип межмолекулярного связывания. Получены данные, что свободная энергия зависит от аксиальных параметров, т.е. минимум свободной энергии определен аксиальной составляющей (Wess et al, 1995). Термодинамические исследования формирования фибрилл in vitro как функции плотности коллагеновых молекул показали, что основной вклад в изменение свободной энергии при встраивании молекул в фибриллы дает энтропийная составляющая. При этом энтальпия системы положительна. В построении фибрилл в продольном направлении участвуют N- и С-концевые глобулярные телопептиды. N-телопептид влияет на образование димеров, расположенных с периодом 4D. Сначала N-телопептид на одной молекуле претерпевает конформационное изменение и связывается со спиральной областью соседней молекулы. Затем С-телопептид стабилизирует упаковку молекул в продольном направлении, связываясь с комплементарным участком тройной спирали. С-телопептид влияет также на боковое объединение линейных агрегатов. После самосборки концевые телопептиды способствуют вторичному связыванию молекул и стабилизации фибрилл путем образования новых межмолекулярных связей (Wallace, 1990). Таким образом, концевые телопептиды играют существенную роль как на ранних стадиях образования фибрилл, так и в процессе стабилизации фибрилл. Исследования последних лет свидетельствуют, что молекулы коллагена упакованы не параллельно длине фибрилл, но под некоторым углом в форме спирали. Для оценки упаковки в продольном направлении фибрилл требуются дополнительные данные о пространственной структуре макромолекул, включая углы суперспиральности а-цепей и радиальной ориентации молекул. 2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл. Все взаимодействия молекул в фибриллах принято различать на аксиальные, совпадающие по направлению с длинной осью фибриллы и радиальные -боковые взаимодействия.
Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей
Установлено, что нарушения в упаковке молекул коллагена связаны со многими заболеваниями соединительных тканей, из которых наиболее распространенными являются остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. (Никитин и др., 1977; Сиро et al., 1981; Frockop, Kivirikko, 1995). Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл до 110-140 нм, который в норме равен 90-100 нм (Kucharz, 1992). Кроме того, в фибриллах нарушается регулярная D-периодическая упаковка молекул. Это может быть следствием заниженного синтеза фибронектина и протеогликанов. Известно, что протеогликаны влияют на упаковку и размеры коллагеновых волокон. В культуре фибробластов in vitro было обнаружено снижение синтеза молекул коллагена типа III, что приводит к изменению соотношения коллагенов типа I и III в коже и в конечном итоге к увеличению диаметра фибрилл. Отсутствие коллагена типа III изменяет упаковку фибрилл таким образом, что диаметр фибрилл существенно увеличивается по сравнению с нормой. Сверхрастяжимость кожи и связок связана с ингибированием поперечного связывания при образовании фибрилл из-за пониженной активности лизилоксидазы, а, следовательно, сниженного числа альдегидных групп в молекулах. На образование фибрилл из молекул коллагена в присутствии pN-коллагена также влияет активность проколлаген-Ы-пептидазы. При пониженной активности фермента значительно нарушается упаковка коллагеновых структур, что приводит к повышенной растяжимости связок при сколиозе и других заболеваниях костно-мышечной системы. Дефекты при синдроме Марфана, которые связаны с аномалиями в тканях глаз, скелетной и сердечно-сосудистой системы, являются также примером изменения упаковки коллагеновых молекул. Повышенная растяжимость тканей связана с пониженной степенью поперечного связывания, которые были вызваны изменениями в структуре а2(1)-цепей. Следовательно, по причине нарушения упаковки тройных спиралей коллагена ослаблены контакты между боковыми цепями аминокислотных остатков в фибриллах. Несовершенный остеогенез относится к группе болезней, связанных как с наследственными дефектами, так и с нарушениями обмена веществ. Наиболее распространенной болезнью является остеопороз.
Наследственные заболевания остеопорозом проявляются не только в повышенной хрупкости костей, но и в истонченной коже, в опалесцирующей зубной эмали и в голубом цвете склеры. Основные дефекты, по-видимому, связаны с коллагеном типа I. Известно, что фибриллы костей состоят только из молекул коллагена типа I. Однако в молодых тканях наряду с коллагеном типа І в небольших количествах присутствует коллаген типа V. При заболевании остеопорозом обнаружено более высокое содержание коллагена типа V по сравнению с нормой, а также коллагена типа III. Молекулы коллагена типа Ш и V могут связываться в фибриллах в gap-зоне, где в норме локализован фосфат кальция, и таким образом могут изменять упаковку молекул коллагена типа І в костях. При остеопорозе обнаружены мутации в генах, кодирующих определенные аминокислоты, как например, глицина (Baum, Brodsky, 1999). Следовательно, изменяется регулярная последовательность триплетов и упаковка молекул в фибриллах. Также обнаружены мутации в генах, приводящие к удалению целых блоков аминокислот, что приводит к укорачиванию а-цепей и изменению упаковки, как молекул, так и фибрилл. Кроме того, при остеопорозе наблюдается пониженный синтез про-а1(І)-цепей, В результате нарушается упаковка тройной спирали коллагена, что впоследствии изменяет упаковку фибрилл. Ненаследственные формы остеопороза, по-видимому, связаны с изменением степени гидроксилирования лизина в молекулах коллагена. Понижение гидроксилирования лизина происходит, когда в организме низкая концентрация Са, что коррелирует с дефицитом витамина D (Кгапе, 1984). Повышение степени гидроксилирования лизина может происходить при заниженной скорости транспортировки про-а-цепей через эндоплазматический ретикулум или в процессе экзоцитоза молекул проколлагена из клетки. При летальной форме остеопороза повышенный уровень гидроксилирования лизина коррелирует с необычно низким диаметром фибрилл (Gay, Miller, 1978). По-видимому, увеличение внутриклеточного разрушения коллагена при пониженной секреции молекул, приводит к низким концентрациям коллагена во внеклеточном пространстве, что значительно изменяет упаковку фибрилл. Методом ренгеноструктурного анализа было показано, что в сухожилиях цыплят с мышечной дистрофией степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой (Stinson, 1975). 2.7. Методы исследования упорядоченных коллагеновых структур. 2.7.1. Метод электронной микроскопии. Большие успехи по установлению упорядоченной структуры коллагеновых фибрилл связаны с применением методов электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Так на электронно-микроскопических снимках коллагеновых фибрилл из разных соединительных тканей выявлена одинаковая поперечная исчерченность в продольном направлении фибрилл (Brodsky, Eikenbary, 1982). Основной участок периодической исчерченности D, равный 64 нм, включает светлую и темную полосы, разделенные на субполосы. Исчерченность коллагеновых фибрилл связана с разной степенью окрашивания полярных и нейтральных аминокислотных остатков при получении образцов для электронно-микроскопических исследований.
Для коллагеновых фибрилл типа I, реконструированных in vitro, показано, что связывание красителей с положительно и отрицательно заряженными группами дает 12 полос на D-период. Регулярность D-периода по данным электронной микроскопии варьирует от 50 им до 67 нм. Периодичность в фибриллах, по-видимому, зависит от типа соединительной ткани и возраста животного. Scott et al в 1981г. определили, что у взрослых животных связывание коллагена с протеогликанами в сухожилиях приводит к периодичности 62 нм, а у молодых к снижению периодичности до 50 нм. У новорожденных периодичность еще ниже и составляет 45 нм. Особенностью фибрилл с пониженной периодичностью является высокое содержание хондроитин-сульфата в молодых тканях. Установлено также изменение периодичности до 53 нм в сухожилиях кролика и до 55 нм в коллагеновых фибриллах роговицы. В работе (Scott, 1988) показано связывание протеогликанов с фибриллами молодых тканей вдоль поверхности фибрилл, а также в gap-зоне. Электронная микроскопия определяет не только периодичность упаковки фибрилл, но и фиксирует ассимметричное строение фибрилл, соответствующее ориентации упаковки молекул от N- к С- концу (Kadler et al, 1996). Было показано, что аксиальный рост фибрилл в сухожилиях эмбрионов цыпленка происходит неравномерно на разных концах фибриллы. На электронно-микроскопическах снимках видны несимметричные острый и тупой концы фибриллы, которые называются а- и Р-концами. Сначала рост фибриллы наблюдается на а-конце, затем через некоторое время - на Р-конце. Показано, что оба конца фибриллы эллипсоидны по форме. Это влечет за собой линейную зависимость увеличения массы фибриллы в зависимости от расстояния. Метод электронной микроскопии, фиксируя D-периодичную упаковку молекул, позволяет установить упорядоченную структуру фибрилл в продольном направлении. Однако упаковка молекул в поперечном направлении не сохраняется, что связано к дегидратацией образцов при их подготовке для анализа. Если сравнивать фибриллы по диаметру, то метод электронной микроскопии дает на 10-40% более низкие значения диаметра по сравнению с методом рентгеновской диф фракции.
Выделение коллагена и очистка
Для выделения и очистки белка из разных тканей применяли методики, предложенные авторами работ (Хилькин и др., 1976; Chandrakasan et aL, 1976; Gelman et al., 1979; Veis et al, 1981) и модифицированные в наших работах. Кожу свиньи очищали от жира и волос, разрезали на кусочки размером 5x5 мм. Проводили предварительную обработку ткани раствором 2 % NaOH, в 2,8 % NaSOj в течение 48 час. Экстракт центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали, осадок обрабатывали 2% раствором борной кислоты до нейтрального рН. Затем промывали осадок дистиллированной водой и обрабатывали 10-кратным объемом 0,5 М раствора уксусной кислоты. Экстракцию проводили в течение 72 час. Для удаления нерастворимого материала гомогенат дважды пропускали через капроновое сито. Проводили осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Экстракт оставляли на 12 час, а затем центрифугировали при 7000g в течение 20 мин. Осадок растворяли в растворе 0,5М уксусной кислоты. Нерастворимую часть удаляли центрифугированием при 18000g в течение 1 час. Проводили повторное осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Осадок перерастворяли в 3-хкратном объеме 0,5М уксусной кислоты и диализовали против 40-кратного объема раствора 0ДМ уксусной кислоты с 3-4 сменами раствора. Диализат центрифугировали при 100000g в течение 2 час. Осадок отбрасывали, супернатант использовали для экспериментов. Все процедуры проводили при температуре 4-6С. 3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс 3.2.2.1. Коллаген с телопептидами Коллаген получали из сухожилий хвостов молодых белых крыс. Хвосты замачивали на ночь в дистиллированной воде. Сухожилия выделяли следующим образом: делали продольный разрез хвоста, снимали кожу и, начиная с конца, разламывали хвост на фрагменты и вытягивали сухожилия. Сухожилия промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 10-кратным объемом раствора 0,5 М уксусной кислоты. Экстракцию проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 72 час в результате 3-х последовательных экстракций, каждая по 24 часа. 1-ый, 2-ой и 3-ий экстракты объединяли и фильтровали через несколько слоев марли. Экстракт разбавляли раствором 0,5М уксусной кислоты и центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Нерастворимые остатки ткани отбрасывали, коллаген супернатанта подвергали 3-хкратной очистке.
Очистку коллагена от примесей и высокомолекулярных агрегатов проводили на разбавленных растворах коллагена концентрации - 1м г/мл. Коллаген получали путем осаждения с последующим центрифугированием и перерастворением в растворе 0,5 М уксусной кислоты. Осаждение проводили раствором 30% NaCI до конечной концентрации 5% NaCI при постоянном перемешивании экстракта на магнитной мешалке и добавлении раствора NaCI из бюретки небольшими порциями. Экстракт оставляли на 12 час. Осадок коллагена отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 час. Перерастворяли коллаген в растворе 0,5 М уксусной кислоты в течение 12 час. Затем проводили диализ в течение 24 час против 40-кратного объема раствора 0,5 М уксусной кислоты с 3-4-хкратной сменой раствора. Диализат центрифугировали при 30000g в течение 2-х час. Верхнюю половину супернатанта использовали для 2-ой очистки по описанной выше процедуре. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. 3-е осаждение коллагена проводили охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 14%. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М NaOH до рН 5,0. Центрифугирование и перерастворение коллагена было выполнено как ранее. Диализ был проведен против раствора 0,1 М уксусной кислоты. Диализованный раствор коллагена центрифугировали на ультрацентрифуге при 160000g в течение 2 час. Верхнюю половину супернатанта использовали для проведения экспериментов. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. Экстракт коллагена, полученный из сухожилий хвостов крыс, центрифугировали при 30000g в течение 2 час для удаления нерастворимого материала, использовали для получения коллагена без телопептидов. Обработку пепсином молекул коллагена проводили при температуре 25С в течение 24 час следующим образом: пепсин добавляли в 0,5М уксуснокислый раствор коллагена концентрации 1мг/мл, рН 2,5 при соотношении фермент/субстрат 1:10, а через 12 час добавляли то же количество пепсина. Затем проводили инактивирование пепсина раствором О, IN NaOH до рН 7,0 и осаждение коллагена охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации спирта 30%. Осадок отделяли центрифугированием при 7000g в течение 1 часа. Супернатант отбрасывали, осадок коллагена ресуспепдировали и перерастворяли в растворе 0,5М растворе уксусной кислоты на магнитной мешалке. Для удаления телопептидов и примеси пепсина проводили второе осаждение коллагена с последующим центрифугированием, перерастворением в растворе 0,5М уксусной кислоты, диализом и ультрацентрифугированием по описанному ранее методу очистки коллагена типа I. 3.3. Методы исследования 3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов Гомогенность коллагеновых молекул после выделения и очистки, а также наличие разных типов коллагена, были проверены методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В работе использована стандартная система электрофореза, предложенная Лемли (Lammli, 1970) и модифицированная в нашей работе. Белок находился в растворе 0,02М Na2HP04, 0,15 NaCl, рН 6,0. Образцы коллагена растворяли в 50 тМ трис-HCl, рН 7,5 с 0,5% SDS и проводили нагревание в течение 5 мин. Использовали 3% концентрирующий и 5% разделяющий гели. Окрашивание белков проводили 0,1% кумасси R-250 в системе метанол-уксусная кислота-вода. В качестве маркерных белков использовали, фосфорилазу Ь: мономер (97400 Да), димер (194800 Да), тример (292000 Да), тетрамер (389600 Да). 3.3.2. Определение концентрации коллагена Концентрацию коллагена определяли по сухому весу белка (Kupke D.W., Dorrier Т.Е.,1978) и модифицированному методу Лоури (Stoscheck, 1990). Коллаген в растворе 0,1М уксусной кислоты и в фосфатно-буферном растворе 0,02 М Na2HP04, 0,15 М NaCl, рН 7,2 высушивали при 105С под вакуумом в течение 4-5 суток. Применяли стеклянные бюксы, где бюксы контроля заполняли растворителем. Взвешивание проводили с точностью до ±0,1 мг. При использовании метода Лоури калибровочным белком была желатина. 3.3.3. Оптические методы. 3.3.3.1. Инфракрасная спектроскопия.
Нативность молекул коллагена была проверена по спектрам поглощения в инфракрасной области на спектрометре UR-20 (ГДР). ИК-спектр тройной спирали коллагена характеризуется рядом полос, связанных с колебаниями амидных и пептидных групп а-цепей. Максимум полосы амид А расположен при - 3330 см 1, а максимум полосы амид I расположен при 1665 см 1. Для анализа использовали пленки образцов, высушенные на кварцевых подложках. Подложки помещали в герметичную кювету с постоянной температурой. 3.3.3.2. Спектрофотометр и я Наличие телопептидов проверяли по спектру поглощения тирозина в дальней ультрафиолетовой области на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР). На УФ-спсктрах поглощения молекул коллагена с целыми телопептидами в растворе 6 М Gu-HCl, 0,03 М Na2HP04,pH 6,5 тирозину соответствует основной пик при 276 нм и дополнительный пик при 282 нм (Na, 1988). Использовали концентрацию молекул 20 мг/мл. Кинетику образования фибрилл изучали по изменению мутности растворов коллагена, как изменения оптической плотности, в зависимости от параметров самосборки молекул. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV VIS (ГДР) на длине волны 400 нм. Использовали 0,5 см и 1 см кварцевые кюветы. Перед заполнением в кювету образец дегазировали. Термостатирование образца в кювете проводили с помощью термостата U 8 (Венгрия). Для калибровки температуры использовали полупроводниковое термо сопротивление МТ-54. Точность определения температуры составляла ±0,ГС. Температура образца достигала нужного значения в течение 2 мин. 3.3.3.3. Поляризационно-оптичсская микроскопия Разрушение комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом под действием коллагеназы исследовали методом поляризационно-оптической микроскопии. Для проведения измерений использовали термомикроскоп типа BOETIUS РНМК-05 (ГДР). Термомикроскоп включает в себя малогабаритный нагревательный стол, встроенное поляризационное устройство и устройство наблюдения. Исследуемый образец помещается между скрещенными полярами.
Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл
Результаты, полученные из кинетических кривых (рис. 9), показывают, что длительность лаг-фазы зависит как от концентрации коллагена, так и от температуры. Увеличение концентрации от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл (в четыре раза) уменьшает длительность лаг-фазы в два раза, что соответствует увеличению числа контактов между молекулами коллагена и облегчает инициацию самосборки (Silver, ВІгк, 1983). Продолжительность лаг-фазы при Т=30С по сравнению с продолжительностью лаг-фазы при Т=25С уменьшена в пять раз. Обнаруженная зависимость лаг-фазы от температуры определяется конформационными изменениями молекул коллагена (Crabtree, Fujimori, 1980; Helseth, Veis, 1981). С увеличением температуры во время лаг-фазы может ускоряться инициация образования микрофибрилл или рост микрофибрилл до промежуточных фибрилл - субфибрилл (Silver, Birk, 1983). В работе (Suarez et al, 1985) показано, что повышение температуры от 25С до 30С приводит к увеличению скорости образования фибрилл и числа субфибрилл в лаг-фазе. При физиологической температуре возможно быстрое изменение конформации молекул, поэтому самосборка молекул коллагена происходит без лаг-фазы при Т=35С. Данные таблицы 4 показывают, что при Т = 30С параметр Ьл увеличивается в четыре раза, а при Т = 35С - в восемь раз по сравнению с параметром t при Т=25С. Так как установлено закономерное изменение величин Ь/г при всех исследуемых концентрациях коллагена (0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл), можно сделать заключение, что, начиная с Т = 30С значительно возрастает скорость образования коллагеновых фибрилл. При Т=35С и концентрации коллагена 1,2 мг/мл образование коллагеновых фибрилл протекает с наибольшей скоростью (параметр Ь/г- 2 мин.). Время формирования стабильной структуры фибрилл, определенное по параметру tp, снижается в три раза с повышением температуры от25Сдо35С. Этими исследованиями показано, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул регулируется кинетика процесса фибриллогенеза in vitro. Известна корреляция между температурой, скоростью образования коллагеновых фибрилл и диаметром фибрилл. Wood et al. в I960 г. определили, что повышение температуры от 25С до 37С приводит к увеличению скорости образования фибрилл в 5-8 раз и к снижению диаметра фибрилл в два раза. Кроме того было установлено, что при Т=20 С диаметр фибрилл равен 200 нм, а при Т= 34С равен 20-70 нм, (Kadler et al., 1996).
По нашим данным при Т= 25С фибриллы образуются с низкой скоростью и могут иметь большой диаметр. Но при Т=26С электронно-микроскопическими измерениями выявлена неплотная упаковка фибрилл (Williams et al, 1978). Изменение диаметра ранее (Wood et al, 1960) связывали с изменением упаковки молекул лишь в поперечном направлении фибрилл. Коллагеновые молекулы в фибриллах при физиологических температурах (Т=34С) претерпевают два конформационных перехода: в конце лаг-фазы, а также во время фазы насыщения (George, Veis, 1990). Изменение конформации связано с формированием суперспиральной структуры фибрилл и взаимной подгонкой молекул как в поперечном, так и в продольном направлении фибрилл. Из этого следует, что при физиологической Т=35С возможна более плотная упаковка фибрилл. Структурные изменения в коллагеновых фибриллах при варьировании температуры и концентрации анализировали по данным, полученным из калориметрических кривых. Для кривых теплопоглощения коллагеновых фибрилл характерны асимметричные пики (рис. 10). С ростом температуры от 25С до 35С интенсивность пика перехода и острота пика возрастают, что характеризует повышение степени кооперативности фибрилл. Полуширина перехода AT возрастает в два раза при относительно низких концентрациях коллагена (0,3-0,6 мг/мл) и в полтора раза при относительно высокой концентрации коллагена (1,2 мг/мл), если сравнивать величины ДТ при Т=25С и Т=35С. Термостабильность фибрилл снижается на 1,5С при увеличении температуры от 25С до 35С. Повышение концентрации в четыре раза не влияет на термостабильность фибрилл. Получены результаты о максимальном значении энтропии и энтальпии фибрилл, образованных при температуре 30С (таблица 5). В работе (Na et al, 1989) установлено, что с ростом температуры от 12С до 27,5С величина энтальпии увеличивается. Однако, Cooper в 1970 г. определил, что образование фибрилл при повышении температур от 20С до 37С сопровождается последовательным уменьшением энтропии и энтальпии. По нашим данным увеличение температуры от 25С до 30С приводит к повышению энтропии, а, следовательно, к разупорядоченпости фибрилл. Увеличение температуры от 30С до 35С приводит к снижению энтропии, что характеризует образование упорядоченной структуры фибрилл. Падение энтропии компенсируется падением энергии из-за образования контактов между сближающимися молекулами коллагена. Когда связывание белковых молекул происходит быстро (сек., мин.), тогда падение энтропии быстро компенсируется падением энергии. В таких условиях процесс самосборки молекул не перекрыт высоким свободно-энергетичесим барьером (Финкельштейн, Птицын, 2002). При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.
По величине энтальпии возможна оценка относительного содержания нековалентных связей в макромолекулах (Эдсол, 1986). Для анализа процесса фибриллогенеза in vitro важно оценить вклад образующихся межмолекулярных связей. Зная энтальпию денатурации молекул коллагена, можно определить энтальпию образования фибрилл AHf (Tiktopulo et al, 1998). Величины AHf указывают (таблица 5), что количество слабых межмолекулярных связей увеличивается с повышением температуры от 25С до 30С и уменьшается с повышением температуры от 30С до 35С. Если сравнивать влияние температур 30С и 35С на фибриллогенез коллагена в зависимости от концентрации, следует отметить снижение числа межмолекулярных связей в два раза при температуре 35С и концентрации 1,2 мг/мл. В физиологических условиях рН, ионной силы и температуры упорядоченная структура фибрилл формируется за счет снижения количества слабых межмолекулярных связей и более плотной упаковки молекул в фибриллах. Компактность коллагеновых молекул или степень их кооперативности в фибриллах оценивали по числу кооперативных участков, формирующих единую кооперативную систему. Число кооперативных участков в молекулах коллагена, л, при условии, что структурные единицы плавятся независимо, вычисляется по формуле (Lumry et al., 1966): н=ДЯ-М Д774Д-Гт2,(1) где М - молекулярный вес коллагена; R - газовая постоянная; Д// - теплота перехода из нативного состояния в разупорядоченное, рассчитанная на грамм белка; Тт - температура перехода из нативного состояния в разупорядоченное; ДТ- полуширина перехода из нативного состояния в разупорядоченное. При физиологической температуре 35С образование фибрилл происходит быстро при всех исследуемых концентрациях коллагеновых молекул (мин.) и сопровождается минимальными величинами энтропии и энтальпии. По-видимому, при температурах 250С, 30С и 35С коллагеновые фибриллы формируются разными путями за счет молекул мономерного коллагена, связываемых и не связываемых в фибриллы. Известно, что на количество коллагеновых молекул, связанных в фибриллы in vitro, влияют условия фибриллогенеза (Cooper, 1970; Na, 1989). По данным Cooper при Т=30С количество связанных молекул максимально, при Т=25С их число меньше, а при Т=35С еще меньше. Общая энтальпия фибрилл складывается из энтальпии коллагеновых молекул и энтальпии образования фибрилл. Результаты по энтальпии сидетельствуют, что общая энтальпия может быть изменена за счет вклада энтальпии несвязанных молекул коллагена.
Структура простых белков представлена только полипептидной цепью (альбумин, инсулин). Однако необходимо понимать, что многие простые белки (например, альбумин) не существуют в "чистом" виде, они всегда связаны с какими-либо небелковыми веществами. Их относят к простым белкам только по той причине, что связи с небелковой группой слабые и при выделении in vitro они оказываются свободным от других молекул - простым белком.
Альбумины
В природе альбумины входят в состав не только плазмы крови (сывороточные альбумины), но и яичного белка (овальбумин), молока (лактальбумин), являются запасными белками семян высших растений.
Глобулины
Группа разнообразных белков плазмы крови с молекулярной массой до 100 кДа, слабокислые или нейтральные . Они слабо гидратированы, по сравнению с альбуминами меньше устойчивы в растворе и легче осаждаются, что используется в клинической диагностике в "осадочных" пробах (тимоловая , Вельтмана). Несмотря на то, что их обычно относят к простым, многие глобулины содержат углеводные или иные небелковые компоненты.
При электрофорезе глобулины сыворотки крови разделяются, как минимум, на 4 фракции – α 1 -глобулины , α 2 -глобулины , β-глобулины и γ-глобулины .
Картина электрофореграммы (вверху) белков сыворотки крови
и полученной на ее основе протеинограммы (внизу)
Так как глобулины включают в себя разнообразные белки, то их функции разнообразны:
Часть α-глобулинов обладает антипротеазной активностью, что защищает белки крови и межклеточного матрикса от преждевременного разрушения, например, α 1 -антитрипсин , α 1 -антихимотрипсин , α 2 -макроглобулин .
Некоторые глобулины способны к связыванию определенных веществ: трансферрин (переносит ионы железа), церулоплазмин (содержит ионы меди), гаптоглобин (переносчик гемоглобина), гемопексин (транспорт гема).
γ-Глобулины являются антителами и обеспечивают иммунную защиту организма.
Гистоны
Гистоны – внутриядерные белки массой около 24 кДа. Обладают выраженными основными свойствами, поэтому при физиологических значениях рН заряжены положительно и связываются с дезоксирибо-нуклеиновой кислотой (ДНК), образуя дезоксирибо-нуклеопротеины . Существуют 5 типов гистонов – очень богатый лизином (29%) гистон Н1, другие гистоны Н2а, H2b, НЗ, Н4 богаты лизином и аргинином (в сумме до 25%).
Радикалы аминокислот в составе гистонов могут быть метилированы, ацетилированы или фосфорилированы. Это изменяет суммарный заряд и другие свойства белков.
Можно выделить две функции гистонов:
1. Регуляция активности генома, а именно – они препятствуют транскрипции.
2. Структурная – стабилизируют пространственную структуру ДНК.
Гистоны в комплексе с ДНК образуют нуклеосомы – октаэдрические структуры, составленные из гистонов Н2а, H2b, НЗ, Н4. Гистон H1 связан с молекулой ДНК, не позволяя ей "соскользнуть" с гистонового октамера. ДНК обвивает нуклеосому 2,5 раза, после чего обвивает следующую нуклеосому. Благодаря такой укладке достигается уменьшение размеров ДНК в 7 раз.
Благодаря гистонам и формированию более сложных структур размеры ДНК, в конечном итоге, уменьшаются в тысячи раз: на самом деле длина ДНК достигает 6-9 см (10 –1) , а размеры хромосом – всего несколько микрометров (10 –6).
Протамины
Это белки массой от 4 кДа до 12 кДа, имеются в ядрах сперматозоидов многих организмов, в сперме рыб (молóках) они составляют основную массу белка. Протамины являются заменителями гистонов и служат для организации хроматина в спермиях. По сравнению с гистонами протамины отличаются резко увеличенным содержанием аргинина (до 80%). Также, в отличие от гистонов, протамины обладают только структурной функцией, регулирующей функции у них нет, хроматин в сперматозоидах неактивен.
Коллаген
Коллаген – фибриллярный белок с уникальной структурой, составляет основу межклеточного вещества соединительной ткани сухожилий, кости, хряща, кожи, но имеется, конечно, и в других тканях.
Полипептидная цепь коллагена включает 1000 аминокислот и носит название α-цепь. Насчитывается около 30 вариантов α-цепи коллагена, но все они обладают одним общим признаком – в большей или меньшей степени включают повторяющийся триплет [Гли-Х-Y ], где X и Y – любые, кроме глицина, аминокислоты. В положении X чаще находится пролин или, гораздо реже, 3-оксипролин , в положении Y встречается пролин и 4-оксипролин . Также в положении Y часто находится аланин , лизин и 5-оксилизин . На другие аминокислоты приходится около трети от всего количества аминокислот.
Жесткая циклическая структура пролина и оксипролина не позволяет образовать правозакрученную α-спираль , но образует т.н. "пролиновый излом". Благодаря такому излому формируется левозакрученная спираль, где на один виток приходится 3 аминокислотных остатка.
При синтезе коллагена первостепенное значение имеет гидроксилирование лизина и пролина , включенных в состав первичной цепи, осуществляемое при участии аскорбиновой кислоты . Также коллаген обычно содержит моносахаридные (галактоза) и дисахаридные (глюкоза-галактоза) молекулы, связанные с ОН-группами некоторых остатков оксилизина.
Этапы синтеза молекулы коллагена
Синтезированная молекула коллагена построена из 3 полипептидных цепей, сплетенных между собой в плотный жгут – тропоколлаген (длина 300 нм, диаметр 1,6 нм). Полипептидные цепи прочно связаны между собой через ε-аминогруппы остатков лизина. Тропоколлаген формирует крупные коллагеновые фибриллы диаметром 10-300 нм. Поперечная исчерченность фибриллы обусловлена смещением молекул тропоколлагена друг относительно друга на 1/4 их длины.
Фибриллы коллагена очень прочны, они прочнее стальной проволоки равного сечения. В коже фибриллы образуют нерегулярно сплетенную и очень густую сеть. Например, выделанная кожа представляет собой почти чистый коллаген.
Гидроксилирование пролина осуществляет железо -содержащий фермент пролилгидроксилаза для которого необходим витамин С (аскорбиновая кислота). Аскорбиновая кислота предохраняет от инактивации пролилгидроксилазу, поддерживая восстановленное состояние атома железа в ферменте. Коллаген, синтезированный в отсутствии аскорбиновой кислоты, оказывается недостаточно гидроксилированным и не может образовывать нормальные по структуре волокна, что приводит к поражению кожи и ломкости сосудов, и проявляется как цинга .
Гидроксилирование лизина осуществляет фермент лизилгидроксилаза. Она чувствительна к влиянию гомогентизиновой кислоты (метаболит тирозина), при накоплении которой (заболевания алкаптонурия ) нарушается синтез коллагена, и развиваются артрозы.
Время полужизни коллагена исчисляется неделями и месяцами. Ключевую роль в его обмене играет коллагеназа , расщепляющая тропоколлаген на 1/4 расстояния с С-конца между глицином и лейцином.
По мере старения организма в тропоколлагене образуется все большее число поперечных связей, что делает фибриллы коллагена в соединительной ткани более жесткими и хрупкими. Это ведет к повышенной ломкости кости и снижению прозрачности роговицы глаза в старческом возрасте.
В результате распада коллагена образуется гидроксипролин . При поражении соединительной ткани (болезнь Пейджета, гиперпаратиреоидизм) экскреция гидроксипролина возрастает и имеет диагностическое значение .
Эластин
|
|
По строению в общих чертах эластин схож с коллагеном. Находится в связках, эластичном слое сосудов. Структурной единицей является тропоэластин с молекулярной массой 72 кДа и длиной 800 аминокислотных остатков. В нем гораздо больше лизина, валина, аланина и меньше гидроксипролина. Отсутствие пролина обусловливает наличие спиральных эластичных участков.
Характерной особенностью эластина является наличие своеобразной структуры – десмозина , который своими 4-мя группами объединяет белковые цепи в системы, способные растягиваться во всех направлениях.
α-Аминогруппы и α-карбоксильные группы десмозина включаются в пептидные связи одной или нескольких белковых цепей.
Fibra волокно)
структурные единицы коллагенового волокна, состоящие из белка коллагена.
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Смотреть что такое "Фибриллы коллагена" в других словарях:
- (fibrillae collagenosae, LNH; лат. fibrilla, уменьшительное от fibra волокно) структурные единицы коллагенового волокна состоящие из белка коллагена … Большой медицинский словарь
- (t. prechondralis; лат. prae перед + греч. chondros хрящ; син. Т. протохондральная) Т. зародыша человека, состоящая из хондробластов и тонких прослоек межклеточного вещества, содержащего фибриллы коллагена; из Т. п. образуется хрящевая Т … Большой медицинский словарь
- (textus, LNH) система клеток и неклеточных структур, объединенных общей функцией, строением и (или) происхождением. Ткань грануляционная (granulationes; син.: грануляции, Т. зернистая) соединительная Т., образующаяся при заживлении дефектов ткани … Медицинская энциклопедия
Врождённая дистрофия стромы роговицы … Википедия
Аггрекан белок, также известный как хрящевой специфичный протеогликановый ядерный белок или протеогликановый хондроитинсульфат … Википедия
Коллаген фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хр … Википедия
I Кость (os) орган опорно двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Совокупность К., связанных (прерывно или непрерывно) соединительной тканью, хрящом или костной тканью, образует Скелет. Общее количество К. скелета… … Медицинская энциклопедия
Или ретикулин термин, обозначающий соединительную ткань, состоящую из коллагена III типа. Ретикулярные волокна формируют ретикулин, то есть сеть, которая составляет основу для ряда мягкотканных органов, таких как печень, костный мозг … Википедия
99. Коллаген: особенности аминокислотного состава, первичной и пространственной структуры. Особенности биосинтеза и созревания коллагена. Роль аскорбиновой кислоты в созревании коллагена.
Коллагены - семейство родственных фибриллярных белков, секретируемых клетками соединительной ткани. Коллагены - самые распространённые белки не только межклеточного матрикса, но и организма в целом, они составляют около 1/4 всех белков организма человека. В межклеточном матриксе молекулы коллагена образуют полимеры, называемые фибриллами коллагена (более подробно это описано в разделе 15). Фибриллы коллагена обладают огромной прочностью и практически нерастяжимы. Они могут выдерживать нагрузку, в 10 000 раз превышающую их собственный вес. По прочности коллагеновые фибриллы превосходят прочность стальной проволоки того же сечения. Именно поэтому большое количество коллагеновых волокон, состоящих из коллагеновых фибрилл, входит в состав кожи, сухожилий, хрящей и костей.
Необычные механические свойства коллагенов связаны с их первичной и пространственной структурами. Молекулы коллагена состоят из трёх полипептидных цепей, называемых α-цепями. Идентифицировано более 20 α-цепей, большинство которых имеет в своём составе 1000 аминокислотных остатков, но цепи несколько отличаются аминокислотной последовательностью. В состав коллагенов могут входить три одинаковые или разные цепи.
Первичная структура α-цепей коллагена необычна, так капи, перевиваясь друг около друга, образуют трёхце-почечную правозакрученную суперспиральную молекулу, часто называемую тропоколлагеном. Цепи удерживаются друг около друга за счёт водородных связей, возникающих между амино- и карбоксильными группами пептидного остова разных полипептидных цепей, входящих в состав трёхспиральной молекулы. "Жёсткие" аминокислоты - пролин и гидроксипролин - ограничивают вращение полипептидного стержня и увеличивают тем самым стабильность тройной спирали. Глицин, имеющий вместо радикала атом водорода, всегда находится в месте пересечения цепей; отсутствие радикала позволяет цепям плотно прилегать друг к другу.
В результате такого скручивания пептидных остовов полипептидных цепей и наличия удлинённой структуры два других радикала из триады аминокислот Гли-X-Y оказываются на наружной поверхности молекулы тропоколлагена. Некоторые комплементарные участки молекул тропоколлагена могут объединяться друг с другом, формируя коллагеновые фибриллы, причём эти участки расположены таким образом, что одна нить тропоколлагена сдвинута по отношению к другой примерно на 1/4. Между радикалами аминокислот возникают ионные, водородные и гидрофобные связи.
Важную роль в формировании коллагеновых фибрилл играют модифицированные аминокислоты: гидроксипролин и гидроксилизин. Гидроксильные группы гидроксипролина соседних цепей тропоколлагена образуют водородные связи, укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Радикалы лизина и гидроксилизина необходимы для образования прочных поперечных сшивок между молекулами тропоколлагена, ещё сильнее укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Кроме того, к гидроксильной группе гидроксилизина могут присоединяться углеводные остатки (гликозилирование коллагена), функция которых пока неясна.
Таким образом, аминокислотная последовательность полипептидных цепей коллагена позволяет сформировать уникальную по своим механическим свойствам структуру, обладающую огромной прочностью. Изменение в первичной структуре коллагена может приводить к развитию наследственных болезней
Синтез и созревание коллагена - сложный многоэтапный процесс, начинающийся в клетке, а завершающийся в межклеточном матриксе. Синтез и созревание коллагена включают в себя целый ряд посттрансляционных изменений:
гидроксилирование пролина и лизина с образованием гидроксипролина (Hyp) и гидроксилизина (Hyl);
гликозилирование гидроксилизина;
частичный протеолиз - отщепление "сигнального" пептида, а также N- и С-концевых пропептидов;
образование тройной спирали.
Синтез полипептидных цепей коллагена
Полипептидные цепи коллагена синтезируются на полирибосомах, связанных с мембранами ЭР, в виде более длинных, чем зрелые цепи, предшественников - препро-α-цепей. У этих предшественников имеется гидрофобный "сигнальный" пептид на N-конце, содержащий около 100 аминокислот.
Основная функция сигнального пептида - ориентация синтеза пептидных цепей в полость ЭР. После выполнения этой функции сигнальный пептид сразу же отщепляется. Синтезированная молекула проколлагена содержит дополнительные участки - N- и С-концевые пропептиды, имеющие около 100 и 250 аминокислот, соответственно. В состав пропептидов входят остатки цистеина, которые образуют внутри- и межцепочечные (только в С-пептидах) S-S-связи. Концевые пропептиды не образуют тройную спираль, а формируют глобулярные домены. Отсутствие N- и С- концевых пептидов в структуре проколлагена нарушает правильное формирование тройной спирали.
Посттрансляционные модификации коллагена
Гидрокслирование пролина и лизина. Роль витамина С
Гидроксилирование пролина и лизина начинается в период трансляции коллагеновой мРНК на рибосомах и продолжается на растущей полипептидной цепи вплоть до её отделения от рибосом. После образования тройной спирали дальнейшее гидроксилирование пролиловых и лизиловых остатков прекращается.
Реакции гидроксилирования катализируют оксигеназы, связанные с мембранами микросом. Пролиловые и лизиловые остатки в Y-положении пептида (Гли-х-у) n подвергаются действию, соответственно, пролил-4-гидроксилазы и лизил-5-гидроксилазы. Пролил-3-гидроксилаза действует на некоторые остатки пролина в Х-положениях. Необходимыми компонентами этой реакции являются оскетоглутарат, О 2 и витамин С (аскорбиновая кислота). Донором атома кислорода, который присоединяется к С-4 пролина, является молекула О 2 , второй атом О 2 включается в сукцинат, который образуется при декарбоксилировании α-кетоглутарата, а из карбоксильной группы а-кетоглутарата образуется СО 2 .
Гидроксилазы пролина и лизина содержат в активном центре атом железа Fe 2+ . Для сохранения атома железа в ферроформе необходим восстанавливающий агент. Роль этого агента выполняет кофермент гидроксилаз - аскорбиновая кислота, которая легко окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту. Обратное превращение происходит в ферментативном процессе за счёт восстановленного глутатиона
Гидроксилирование пролина необходимо для стабилизации тройной спирали коллагена, ОН-группы гидроксипролина (Hyp) участвуют в образовании водородных связей. А гидроксилирование лизина очень важно для последующего образования ковалентных связей между молекулами коллагена при сборке коллагеновых фибрилл. При цинге - заболевании, вызванном недостатком витамина С, нарушается гидроксилирование остатков пролина и лизина. В результате этого образуются менее прочные и стабильные коллагеновые волокна, что приводит к большой хрупкости и ломкости кровеносных сосудов с развитием цинги. Клиническая картина цинги характеризуется возникновением множественных точечных кровоизлияний под кожу и слизистые оболочки, кровоточивостью дёсен, выпадением зубов, анемией.
Гликозилирование гидроксилизина
После завершения гидроксилирования при участии специфических гликозилтрансфераз в состав молекулы проколлагена вводятся углеводные группы. Чаще всего этими углеводами служат галактоза или дисахарид галактозилглюкоза.
Они образуют ковалентную О-гликозидную связь с 5-ОН-группой гидроксилизина. Гликозилирование гидроксилизина происходит в коллагене, ещё не претерпевшем спирализации, и завершается после образования тройной спирали. Число углеводных единиц в молекуле коллагена зависит от вида ткани. Так, например, в коллагене сухожилий (тип I) это число равно 6, а в коллагене капсулы хрусталика (тип IV) - НО. Роль этих углеводных групп неясна; известно только, что при наследственном заболевании, причиной которого является дефицит лизилгидроксилазы (синдром Элерса - Данло-Русакова, тип VI), содержание гидроксилизина и углеводов в образующемся коллагене снижено; возможно, это является причиной ухудшения механических свойств кожи и связок у людей с этим заболеванием.
Образование проколлагена и его секреция в межклеточное пространство
После гидроксилирования и гликозилирования каждая про-α-цепь соединяется водородными связями с двумя другими про-α-цепями, образуя тройную спираль проколлагена. Эти процессы происходят ещё в просвете ЭР и начинаются после образования межцепочечных дисульфидных мостиков в области С-концевых пропептидов. Из ЭР молекулы проколлагена перемещаются в аппарат Гольджи, включаются в секреторные пузырьки и секретируются в межклеточное пространство.
100. Структурная организация межклеточного матрикса. Адгезивные белки межклеточного матрикса: фибронектин и ламинин, их строение и функции. Строение и функции гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов, гепарина). Структура протеогликанов.
Гликозаминогликаны - линейные отрицательно заряженные гетерополисахариды. Раньше их называли мукополисахаридами, так как они обнаруживались в слизистых секретах (мукоза) и придавали этим секретам вязкие, смазочные свойства. Эти свойства обусловлены тем, что гликозаминогликаны могут связывать большие количества воды, в результате чего межклеточное вещество приобретает желеобразный характер.
Протеогликаны - высокомолекулярные соединения, состоящие из белка (5-10%) и гликозаминогликанов (90-95%). Они образуют основное вещество межклеточного матрикса соединительной ткани и могут составлять до 30% сухой массы ткани.
Белки в протеогликанах представлены одной полипептидной цепью разной молекулярной массы. Полисахаридные компоненты у разных протеогликанов разные. Протеогликаны отличаются от большой группы белков, которые называют гликопротеинами. Эти белки тоже содержат олигосахаридные цепи разной длины, ковалентно присоединённые к полипептидной основе. Углеводный компонент гликопротеинов гораздо меньше по массе, чем у протеогликанов, и составляет не более 40% от общей массы. Гликопротеины выполняют в организме человека разные функции и присутствуют во всех классах белков - ферментах, гормонах, транспортных, структурных белках и др. Представители гликопротеинов - коллаген и эластин, иммуноглобулины, ангиотензиноген, трансферрин, церулоплазмин, внутренний фактор Касла, тиреотропный гормон.
Гликозаминогликаны и протеогликаны, являясь обязательными компонентами межклеточного матрикса, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях, формировании и поддержании формы клеток и органов, образовании каркаса при формировании тканей.
Благодаря особенностям своей структуры и физико-химическим свойствам, протеогликаны и гликозаминогликаны могут выполнять в организме человека следующие функции:
они являются структурными компонентами межклеточного матрикса;
протеогликаны и гликозаминогликаны специфически взаимодействуют с коллагеном, эластином, фибронектином, ламинином и другими белками межклеточного матрикса;
все протеогликаны и гликозаминогликаны, являясь полианионами, могут присоединять, кроме воды, большие количества катионов (Na + , K+, Са 2+) и таким образом участвовать в формировании тургора различных тканей;
протеогликаны и гликозаминогликаны играют роль молекулярного сита в межклеточном матриксе, они препятствуют распространению патогенных микроорганизмов;
гиалуроновая кислота и протеогликаны выполняют рессорную функцию в суставных хрящах;
гепарансульфатсодержащие протеогликаны способствуют созданию фильтрационного барьера в почках;
кератансульфаты и дерматансульфаты обеспечивают прозрачность роговицы;
гепарин - антикоагулянт;
гепарансульфаты - компоненты плазматических мембран клеток, где они могут функционировать как рецепторы и участвовать в клеточной адгезии и межклеточных взаимодействиях. Они также выступают компонентами синаптических и других пузырьков.
Строение и классы гликозаминогликатов
Гликозаминогликаны представляют собой длинные неразветвлённые цепи гетерополиса-харидов. Они построены из повторяющихся дисахаридных единиц. Одним мономером этого дисахарида является гексуроновая кислота (D-глюкуроновая кислота или L-идуроновая), вторым мономером - производное аминосахара (глюкоз- или галактозамина). NH 2 -rpyппa аминосахаров обычно ацетилирована, что приводит к исчезновению присущего им положительного заряда. Кроме гиалуроновой кислоты, все гликозаминогликаны содержат сульфатные группы в виде О-эфиров или N-сульфата.
Гиалуроновая кислота находится во многих органах и тканях. В хряще она связана с белком и участвует в образовании протеогликановых агрегатов, в некоторых органах (стекловидное тело глаза, пупочный канатик, суставная жидкость) встречается и в свободном виде. Предполагается, что в суставной жидкости гиалуроновая кислота выполняет роль смазочного вещества, уменьшая трение между суставными поверхностями.Гиалуроновая кислота содержит несколько тысяч дисахаридных единиц, молекулярная масса её достигает 10 5 - 10 7 Д.
Хондроитинсульфаты - самые распространённые гликозаминогликаны в организме человека; они содержатся в хряще, коже, сухожилиях, связках, артериях, роговице глаза. Хондроитинсульфаты являются важным составным компонентом агрекана - основного протеогликана хрящевого матрикса. В организме человека встречаются 2 вида хондроитинсульфатов: хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат. Они построены одинаковым образом, отличие касается только положения сульфатной группы в молекуле N-ацетилгалактозамина.Одна полисахаридная цепь хондроитинсульфата содержит около 40 повторяющихся дисахаридных единиц и имеет молекулярную массу 10 4 - 10 6 Д.
Кератансульфаты - наиболее гетерогенные гликозаминогликаны; отличаются друг от друга по суммарному содержанию углеводов и распределению в разных тканях. Кератансульфат I находится в роговице глаза и содержит кроме повторяющейся дисахаридной единицы L-фукозу, D-маннозу и сиаловую кислоту. Кератансульфат II был обнаружен в хрящевой ткани, костях, межпозвоночных дисках. В его состав помимо Сахаров дисахаридной единицы входят N-ацетилгалактозамин, L-фукоза, D-манноза и сиаловая кислота. Кератансульфат II входит в состав агрекана и некоторых малых протеогликанов хрящевого матрикса. В отличие от других гликозаминогликанов, кератансульфаты вместо гексуроновой кислоты содержат остаток галактозы.
Молекулярная масса одной цепи кератансульфата колеблется от 4 × 10 3 до 20 × 10 3 Д.
Дерматансульфат широко распространён в тканях животных, особенно он характерен для кожи, кровеносных сосудов, сердечных клапанов.В составе малых протеогликанов (бигликана и декорина) дерматансульфат содержится в межклеточном веществе хрящей, межпозвоночных дисков, менисков. Повторяющаяся дисахаридная единица дерматансульфата имеет следующую структуру. Молекулярная масса одной цепи дерматансульфата колеблется от 15 × 10 3 до 40 × 10 3 Д.
Гепарин - важный компонент противосвёртывающей системы крови (его применяют как антикоагулянт при лечении тромбозов). Он синтезируется тучными клетками и находится в гранулах внутри этих клеток. Наибольшие количества гепарина обнаруживаются в лёгких, печени и коже. Дисахаридная единица гепарина похожа на дисахаридную единицу гепарансульфата. Отличие этих гликозаминогликанов заключается в том, что в гепарине больше N-сульфатных групп, а в гепарансульфате больше N-ацетильных групп. Молекулярная масса гепарина колеблется от 6 × 10 3 до 25 × 10 3 Д.
Гепарансульфат находится во многих органах и тканях. Он входит в состав протеогликанов базальных мембран. Гепарансульфат является постоянным компонентом клеточной поверхности. Структура дисахаридной единицы гепарансульфата такая же, как у гепарина. Молекулярная масса цепи гепарансульфата колеблется от 5 × 10 3 до 12 × 10 3 Д.
Cтроение и виды протеогликанов
В межклеточном матриксе присутствуют разные протеогликаны. Среди них есть очень крупные - например агрекан и версикан. Кроме них, в межклеточном матриксе имеется целый набор так называемых малых протеогликанов, которые широко распространены в разных видах соединительной ткани и выполняют там самые разнообразные функции.
Основной протеогликан хрящевого матрикса называется агрекан, он составляет 10% по весу исходной ткани и 25% сухого веса хрящевого матрикса. Это очень большая молекула, в которой к одной полипептидной цепи присоединены до 100 цепей хондроитинсульфатов и около 30 цепей кератансульфатов. По форме молекула агрекана напоминает бутылочный "ёршик" .
В хрящевой ткани молекулы агрекана собираются в агрегаты с гаалуроновой кислотой и небольшим связывающим белком. Оба компонента присоединяются к агрекану нековалент-ными связями в области домена G 1 . Домен G 1 взаимодействует примерно с пятью дисахаридными единицами гиалуроновой кислоты, далее этот комплекс стабилизируется связывающим белком; домен G 1 и связывающий белок вместе занимают 25 дисахаридных единиц гиалуроновой кислоты. Конечный агрегат с молекулярной массой более 200 × 10 6 Д состоит из одной молекулы гиалуроновой кислоты и 100 молекул агрекана (и такого же количества связывающего белка). Координация сборки этих агрегатов является центральной функцией хондроцитов. Агрекан и связывающий белок продуцируются этими клетками в необходимых количествах. Эти компоненты могут взаимодействовать друг с другом внутри клетки, но процесс агрегации полностью завершается в межклеточном матриксе. Показано, что гиалуроновая кислота образуется на поверхности хондроцитов специфической синтетазой и "выталкивается" в межклеточное пространство, чтобы связаться с агреканом и связывающим белком. Созревание функционально активного тройного комплекса составляет около 24 ч.
Малые протеогликаны
Малые протеогликаны - протеогликаны с низкой молекулярной массой. Они содержатся в хрящах, сухожилиях, связках, менисках, коже и других видах соединительной ткани.
Эти протеогликаны имеют небольшой коровый белок, к которому присоединены одна или две цепи гликозаминогликанов. Наиболее изучены декорин, бигликан, фибромодулин, люмикан, перлекан.
Коровые белки бигликана и декорина похожи по размерам и структуре (молекулярная масса 36 000 и 38 000 Д, соответственно). Они имеют несколько тандемных повторов, богатых лейцином, которые образуют α-спирали или β-структуры. На N- и С-концах этих белков имеются домены, содержащие S-S-связи. Ко"ровые белки значительно различаются по первичной структуре в N-концевых областях, что определяет различия в присоединении гликозаминогликанов. Бигликан содержит серии в положениях 5 и 11, что обеспечивает присоединение двух полисахаридных цепей. Декорин содержит один серии в положении 4, поэтому к нему присоединяется одна полисахаридная цепь. У этих протеогликанов полисахаридные цепи представлены дерматансульфатом с молекулярной массой ~ 30 000 Д (рис. 15-17).
Ко́ровый белок фибромодулина (молекулярная масса ~ 40 000 Д) тоже имеет области тандемных повторов, богатые лейцином, но его N-концевая область отличается тем, что не содержит серина, а имеет несколько сульфатированных остатков тирозина, поэтому одна или две цепи кератансульфата присоединяются к ко"ровому белку фибромодулина не в N-концевой, а в области, богатой лейцином, через NH 2 -группу аспарагина.
Малые протеогликаны являются мультифункциональными макромолекулами. Они могут связываться с другими компонентами соединительной ткани и оказывать влияние на их строение и функции. Например, декорин и фибромодулин присоединяются к фибриллам коллагена II типа и ограничивают их диаметр (т.е. препятствуют образованию толстых фибрилл). Декорин и бигликан, присоединяясь к фибронектину, подавляют клеточную адгезию, а присоединяясь к фактору роста опухолей (3, снижают его митогенную активность. Кроме этого, имеется большое количество данных о том, что малые протеогликаны играют важную регуляторную роль в процессах развития и восстановления соединительной ткани.
Протеогликаны базальных мембран
Протеогликаны базальных мембран отличаются значительной гетерогенностью. Это преимущественно гепарансульфатсодержащие протеогликаны (ГСПГ), представленные двумя разновидностями: высокой и низкой плотности
Структурная организация межклеточного матрикса. Адгезивные белки межклеточного матрикса: фибронектин и ламинин, их строение и функции.
Белки межклеточного матрикса выполняют различные функции, но их можно разделить на две большие группы по одному весьма важному признаку: 1) белки, обладающие адгезивными свойствами; 2) белки, подавляющие адгезию клеток.
А. Aдгезивные белки
К первой группе белков с выраженными адгезивными свойствами относят фибронектин, ламинин, нидоген, фибриллярные коллагены и коллаген IV типа; их относят к белкам "зрелой" соединительной ткани.
Фибронектин
Фибронектин - один из ключевых белков межклеточного матрикса, неколлагеновый структурный гликопротеин, синтезируемый и выделяемый в межклеточное пространство многими клетками. Он построен из двух идентичных полипептидных цепей, соединённых дисульфидными мостиками у своих С-концов.
Полипептидная цепь фибронектина содержит 7-8 доменов, на каждом из которых расположены специфические центры для связывания разных веществ. Фибронектин может связывать коллаген, протеогликаны, гиалуроновую кислоту, углеводы плазматических мембран, гепарин, фермент трансглутаминазу. Благодаря своей структуре фибронектин может выполнять интегрирующую роль в организации межклеточного вещества, а также способствовать адгезии клеток.
Существует несколько форм фибронектина, которые синтезируются разными клетками. Растворимый, или плазменный, фибронектин синтезируется гепатоцитами. Нерастворимый, или тканевый фибронектин синтезируется в основном фибробластами или эндотелиоцитами, глиоцитами и эпителиальными клетками.
Обе формы фибронектина вовлекаются в разнообразные процессы: способствуют адгезии и распространению эпителиальных и мезенхимальных клеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эмбриональных и опухолевых клеток, контролируют дифференцировку и поддержание цитоскелета клеток, активно участвуют в воспалительных и репаративных процессах. Это связано с тем, что каждая субъединица фибронектина содержит последовательность Арг-Гли-Асп (RGD), с помощью которой он может присоединяться к клеточным рецепторам (интегринам). Эти рецепторы опосредованно взаимодействуют с актиновыми микрофиламентами, которые находятся в цитозоле. В этом процессе участвуют так называемые белки прикрепления (от англ. attach - прикреплять proteins ): талин, винкулин, α-актинин.
С помощью таких белок-белковых взаимодействий информация может передаваться из межклеточного матрикса внутрь клетки, а также в обратном направлении - из клетки наружу, таким образом влияя на протекающие в клетке процессы.
Известно также, что фибронектин участвует в миграции клеток, которые могут присоединяться к его RGD-участкам, и, таким образом, фибронектин как бы помогает им перемещаться в межклеточном матриксе.
В межклеточном матриксе, окружающем трансформированные (или опухолевые) клетки, количество фибронектина заметно снижено, что может быть одной из причин появления метастазов.
Ламинин - наиболее распространённый некол-лагеновый гликопротеин базальных мембран. Он состоит из трёх полипетидных цепей: А, В 1 и В 2 . Молекула ламинина имеет крестообразную форму с тремя одноцепочечными ветвями и одной трёхцепочечной ветвью. Каждая цепь ламинина содержит несколько глобулярных и стержневидных доменов, на которых имеются специфические центры связывания для различных веществ. Ламинин взаимодействует со всеми структурными компонентами базальных мембран, включая коллаген IV типа, нидоген, фибронектин, ГСПГ. Кроме того, молекула ламинина имеет несколько центров связывания с клетками. Главные функции ламинина определяются его способностью связывать клетки и модулировать клеточное поведение. Он может влиять на рост, морфологию, дифференцировку и подвижность клеток.
Ламинин выполняет роль адгезивного белка для различных эпителиальных и мезенхимальных клеток.
Нидоген - сульфатированный гликопротеин базальных мембран, образует с ламинином плотный, нековалентно связанный комплекс; сила связывания нидогена с коллагеном IV типа гораздо меньше, чем с ламинином. Этот белок представлен одной полипептидной цепью, содержащей три глобулярных домена. Один из доменов нидогена имеет центр связывания ламинина, в области другого домена находится центр связывания коллагена IV типа. Таким образом, нидоген может выступать в качестве одного из связывающих мостов между различными компонентами межклеточного матрикса и участвовать в образовании тройных комплексов ламинин-нидоген-коллаген. Кроме этого, нидоген содержит RGD-последовательность и поэтому может присоединяться к клеточной поверхности.
Антиадгезивные белки
Ко второй группе белков, обладающих антиадгезивными свойствами, относят такие гликопротеины, как остеонектин, тенасцин и тромбоспондин. Эти белки появляются и играют заметную роль в эмбриогенезе и морфогенезе, развитии клеточного ответа на повреждение. Их концентрация в матриксе повышается при некоторых опухолевых заболеваниях.
Остеонектин (синонимы: ВМ-40, SPARC, от англ, secreted protein acidic and rich in cysteine ) состоит из 4 доменов, к 2 из которых могут присоединяться ионы Са 2+ . Остеонектин - кислый белок, богатый цистеином. Показано, что он может ингибировать G 1 -S"-фазу роста эндотелиальных клеток.
Тенасцин (антиген мышечных сухожилий) - олигомерный гликопротеин, состоящий, подобно фибронектину, из 2 субъединиц, соединённых дисульфидной связью. Эту большую молекулу, похожую на осьминога, называют ещё "гексабрахион", так как она имеет 6 "рук", отходящих радиально от одного участка. Благодаря такому строению, тенасцин может взаимодействовать с большим количеством лигандов, к которым относят различные молекулы межклеточного матрикса.
Тенасцин обладает как адгезивными, так и антиадгезивными свойствами, синтезируется в различных тканях эмбриона (наиболее интенсивно - в зонах эпителиальномезинхимальных контактов и в развивающейся нервной ткани). В зрелых тканях небольшие количества тенас-цина находятся в сухожилиях и хрящах, его синтез увеличивается в заживающих ранах.
Тромбоспондин, как и другие белки межклеточного матрикса, может взаимодействовать со многими лигандами: коллагеном, фибронектином, ламинином, протеогликанами, ионами Са 2+ и др. В клетках роговицы глаза и тромбоцитах Тромбоспондин проявляет адгезивные свойства, а в клетках эндотелия и фибробластах он функционирует как антиадгезивный белок.
Таким образом, функции этих белков определяются их локализацией и окружением.
101. Молекулярная структура миофибрилл. Структура и функция основных белков миофибрилл миозина, актина, тропомиозина, тропонина.
К группе миофибриллярных белков относятся миозин, актин и актомиозин – белки, растворимые в солевых средах с высокой ионной силой, и так называемые регуляторные белки: тропомиозин, тропонин, α- и β-актинин, образующие в мышце с актомиозином единый комплекс. Перечисленные миофибриллярные белки тесно связаны с сократительной функцией мышц
Молекулярная масса миозина скелетных мышц около 500000. Молекула миозина (рис. 20.3) имеет сильно вытянутую форму, длину 150 нм. Она может быть расщеплена без разрыва ковалентных связей на субъединицы: две тяжелые полипептидные цепи с мол. массой 205000–210000 и несколько коротких легких цепей, мол. масса которых около 20000. Тяжелые цепи образуют длинную закрученную α-спираль («хвост» молекулы), конец каждой тяжелой цепи совместно с легкими цепями создает глобулу («головка» молекулы), способную соединяться с актином. Эти «головки» выдаются из основного стержня молекулы. Легкие цепи, находящиеся в «головке» миозиновой молекулы и принимающие участие в проявлении АТФазной активности миозина, гетерогенны по своему составу.
Строение молекулы миозина
Актин, составляющий 20% от сухой массы миофибрилл, был открыт Ф. Штраубом в 1942 г. Известны две формы актина: глобулярный актин (G-актин) и фибриллярный актин (F-актин). Молекула G-актина с мол. массой 42000 состоит из одной полипептидной цепочки (глобула), в образовании которой принимают участие 374 аминокислотных остатка. При повышении ионной силы до физиологического уровня G-актин полимеризуется в F-актин (фибриллярная форма). На электронных микрофотографиях волокна F-актина выглядят как две нити бус, закрученных одна вокруг другой (рис. 20.5). Актиомиозин образуется при соединении миозина с F-актином. Актиомиозин, как естественный, так и искусственный, т.е. полученный путем соединения in vitro высокоочищенных препаратов миозина и F-актина, обладает АТФазной активностью, которая отличается от таковой миозина, АТФазная активность миозина значительно возрастает в присутствии стехиометрических количеств F-актина. Фермент актомиозин активируется ионами Mg2+и ингибируется этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и высокой концентрацией АТФ, тогда как миозиновая АТФаза ингибируется ионами Mg2+, активируется ЭДТА и не ингибируется высокой концентрацией АТФ. Оптимальные значения рН для обоих ферментов также различны. Как отмечалось, кроме рассмотренных основных белков, в миофибриллах содержатся также тропомиозин, тропонин и некоторые другие регуляторные белки.
Структура тонкого филамента. 1 - актин; 2 - тропомиозин; 3 - тропонин С; 4 - тропонин I; 5 - тропонин Т.
Тропомиозин был открыт К. Бейли в 1946 г. Молекула тропомиозина состоит из двух α-спиралей и имеет вид стержня длиной 40 нм; его мол. масса 65000. На долю тропомиозина приходится около 4–7% всех белков миофибрилл. Тропонин – глобулярный белок, открытый С. Эбаси в 1963 г.; его мол. масса 80000. В скелетных мышцах взрослых животных и человека тропонин (Тн) составляет лишь около 2% от всех миофибриллярных белков. В его состав входят три субъединицы (Тн-I, Тн-С, Тн-Т). Тн-I (ингибирующий) может ингибировать АТФазную активность, ТН-С (кальцийсвязывающий) обладает значительным сродством к ионам кальция, Тн-Т (тропомиозин-связывающий) обеспечивает связь с тропомиозином.
Тропонин, соединяясь с тропомиозином, образует комплекс, названный нативным тропомиозином. Этот комплекс прикрепляется к актиновым филаментам и придает актомиозину скелетных мышц позвоночных чувствительность к ионам Са2+ . Установлено, что тропонин (его субъединицы Тн-Т и Тн-I) способен фосфорилироваться при участии цАМФ-зависимых протеинкиназ.
102. Биохимические механизмы мышечного сокращения и расслабления. Роль ионов кальция и других ионов в регуляции мышечного сокращения. Особенности энергетического обмена в мышцах; роль креатинфосфата.
Рассмотрим, к чему сводятся представления о механизме попеременного сокращения и расслабления мышц. В настоящее время принято считать, что биохимический цикл мышечного сокращения состоит из 5 стадий (рис. 20.8): 1) миозиновая «головка» может гидролизовать АТФ до АДФ и Н3РО4 (Pi), но не обеспечивает освобождения продуктов гидролиза. Поэтому данный процесс носит скорее стехиометрический, чем каталитический, характер (см. рис. 20.8, а);
3) это взаимодействие обеспечивает высвобождение АДФ и Н3РО4 из актин-миозинового комплекса. Актомиозиновая связь имеет наименьшую энергию при величине угла 45°, поэтому изменяется угол миозина с осью фибриллы с 90° на 45° (примерно) и происходит продвижение актина (на 10–15 нм) в направлении центра саркомера (см. рис. 20.8, в);
4) новая молекула АТФ связывается с комплексом миозин–F-актин (см. рис. 20.8, г); Рис. 20.8. Биохимический цикл мышечного сокращения. Объяснение в тексте.
5) комплекс миозин–АТФ обладает низким сродством к актину, и поэтому происходит отделение миозиновой (АТФ) «головки» от F-актина. Последняя стадия и есть собственно расслабление, которое отчетливо зависит от связывания АТФ с актин-миозиновым комплексом (см. рис. 20.8, д). Затем цикл возобновляется.
Регуляция сокращения и расслабления мышц . Сокращение любых мышц происходит по общему механизму, описанному ранее. Мышечные волокна разных органов могут обладать различными молекулярными механизмами регуляции сокращения и расслабления, однако всегда ключевая регулятор-ная роль принадлежит ионам Са2+. Установлено, что миофибриллы обладают способностью взаимодействовать с АТФ и сокращаться в его присутствии лишь при наличии в среде определенных концентраций ионов кальция. Наибольшая сократительная активность наблюдается при концентрации ионов Са2+ около 10–6–10–5 М. При понижении концентрации до 10–7 М или ниже мышечные волокна теряют способность к укорочению и развитию напряжения в присутствии АТФ. По современным представлениям, в покоящейся мышце (в миофибрил-лах и межфибриллярном пространстве) концентрация ионов Са2+ поддерживается ниже пороговой величины в результате связывания их структурами (трубочками и пузырьками) саркоплазматической сети и так называемой Т-системой при участии особого Са2+-связывающего белка, получившего название кальсеквестрина, входящего в состав этих структур. Связывание ионов Са2+ разветвленной сетью трубочек и цистерн сарко-плазматической сети не является простой адсорбцией. Это активный физиологический процесс, который осуществляется за счет энергии, освобождающейся при расщеплении АТФ Са2+-зависимой АТФазой саркоплазматической сети. При этом наблюдается весьма своеобразная картина: скорость выкачивания ионов Са2+ из межфибриллярного пространства стимулируется этими же ионами. В целом такой механизм получил название «кальциевая помпа» по аналогии с хорошо известным в физиологии натриевым насосом. Возможность пребывания живой мышцы в расслабленном состоянии при наличии в ней достаточно высокой концентрации АТФ объясняется снижением в результате действия кальциевой помпы концентрации ионов Са2+ в среде, окружающей миофибриллы, ниже того предела, при котором еще возможны проявление АТФазной активности и сократимость акто-миозиновых структур волокна. Быстрое сокращение мышечного волокна при его раздражении от нерва (или электрическим током) является результатом внезапного изменения проницаемости мембран и как следствие выхода из цистерн и трубочек саркоплазматической сети и Т-системы некоторого количества ионов Са2+ в саркоплазму. Как отмечалось, «чувствительность» актомиозиновой системы к ионам Са2+ (т.е. потеря актомиозином способности расщеплять АТФ и сокращаться в присутствии АТФ при снижении концентрации ионов Са2+ до 10–7 М) обусловлена присутствием в контрактильной системе (на нитях F-акти-на) белка тропонина, связанного с тропомиозином. В тропонин-тропомио-зиновом комплексе ионы Са2+ связываются именно с тропонином. В молекуле тропонина при этом происходят конформационные изменения, которые, по-видимому, приводят к сдвигу всего тропонин-тропомиози-нового стержня и деблокировке активных центров актина, способных взаимодействовать с миозином с образованием сократительного комплекса и активной Mg2+-АТФазы. В продвижении актиновых нитей вдоль миозиновых, по данным Э. Хаксли, важную роль играют временно замыкающиеся между нитями поперечные мостики, которые являются «головками» миозиновых молекул. Итак, чем большее число мостиков прикреплено в данный момент к акти-новым нитям, тем больше сила мышечного сокращения. Наконец, если возбуждение прекращается, содержание ионов Са2+ в саркоплазме снижается (кальциевая помпа), то циклы прикрепление–освобождение прекращаются, т.е. «головки» миозиновых нитей перестают прикрепляться к актиновым нитям. В присутствии АТФ мышца расслабляется и ее длина достигает исходной. Если прекращается поступление АТФ (аноксия, отравление дыхательными ядами или смерть), то мышца переходит в состояние окоченения. Почти все поперечные мостики толстых (миозиновых) нитей присоединены при этом к тонким актиновым нитям, следствием чего и является полная неподвижность мышцы.
Энергетический обмен в мышечной ткани
103. Химический состав нервной ткани. Миелиновые мембраны: особенности состава и структуры. Энергетический обмен в нервной ткани. Значение аэробного распада глюкозы. Медиаторы нервной системы. Физиологически активные пептиды мозга.
1. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НЕРВНОЙ ТКАНИ.
Химический состав нервной ткани сложен и неоднороден, как в целом и сама нервная ткань. Отличия в химическом составе носят в основном количественный характер. В сером веществе 77 -81% воды, в белом-70%. Содержание белков в нервной ткани меньше, чем в некоторых других тканях (печень, мышцы). Их больше в сером веществе и меньше в периферических нервах. В нервной ткани содержится больше сложных белков: ЛИПОПРОТЕИНЫ (миелиновые оболочки), ФОСФОПРОТЕИНЫ, НУКЛЕОПРОТЕИНЫ (ДНП, РНП), ГЛИКОПРОТЕИНЫ (нейрокератин), En.
Наибольший интерес представляют нейроспецифические белки:
1. белок S-100 (растворим в 100% растворе (NH4)2SO4). Он повышается в ткани мозга в эксперименте при обучении и эмоциональном воздействии. Считают, что этот белок отвечает за формирование зависимостей (алкогольной, наркотической). ПРОПРОТЕИН - антитело к белку S-100, понижает его содержание в ткани мозга.
2. Белок 14-3-2 играет важную роль в формировании памяти.
3. НЕЙРОПЕПТИДЫ - играют роль нейромедиаторов и гормонов. Пептиды памяти, боли, сна. Не белковые азотистые соединения те же самые, что и в других тканях, но отличаются по
количественному составу. В нервной ткани много свободных аминокислот, г.о. дикарбоновых (ГЛУ, ГЛН, ACП, АСН), ГАМК, ароматические аминокислоты, ЦАМФ и ЦГМФ. Углеводов незначительное количество:
1. резервные углеводы - гликоген (0,1 %)
2. глюкоза (1 -4мкмоль/л)
3. гексозофосфаты
4. триозофосфаты
6. молочная кислота.
ЛИПИДОВ в сером веществе 25%, в белом веществе 50%.
1. ФОСФОЛИПИДЫ (до 50%) - ПЛАЗМОГЕН АЦЕТАЛЬФОСФАТИДЫ.
2. ГЛИКОЛИПИДЫ - ЦЕРЕБРОЗИДЫ, ГАНГЛИОЗИДЫ.
3. ВЖК - в основном непредельные, содержащие по 4 - 5 двойных связей.
4. Холестерин (25%) в свободном виде. Мозг даже называют депо холестерина.
5. Нейтральные жиры - в незначительном количестве в головном, но в большом количестве в периферических нервах.
Минеральные вещества представлены катионами калия, натрия, кальция, магния, железа, меди, цинка, в качестве анионов выступают анионы белков и фосфаты.
Миелиновая оболочка - электроизолирующая оболочка, покрывающая аксоны многих нейронов. Миелиновую оболочку образуют глиальные клетки: в периферической нервной системе - Шванновские клетки, в центральной нервной системе -олигодендроциты. Миелиновая оболочка формируется из плоского выроста тела глиальной клетки, многократно оборачивающего аксон подобно изоляционной ленте. Цитоплазма в выросте практически отсутствует, в результате чего миелиновая оболочка представляет собой, по сути, множество слоёв клеточной мембраны.
Миелин прерывается только в области перехватов Ранвье, которые встречаются через правильные промежутки длиной примерно 1 мм. В связи с тем, что ионные токи не могут проходить сквозь миелин, вход и выход ионов осуществляется лишь в области перехватов. Это ведёт к увеличению скорости проведения нервного импульса. Таким образом, по миелинизированным волокнам импульс проводится приблизительно в 5-10 раз быстрее, чем по немиелинизированным.
Из вышесказанного становится ясным, что миелин и миелиновая оболочка являются синонимами. Обычно термин миелин употребляется в биохимии, вообще при упоминании его молекулярной организации, а миелиновая оболочка - в морфологии и физиологии.
Химический состав и структура миелина, произведённого разными типами глиальных клеток, различны. Цвет миелинизированных нейронов - белый, отсюда название «белого вещества» мозга.
Приблизительно на 70-75 % миелин состоит из липидов, на 25-30 % - из белков. Такое высокое содержание липидов отличает миелин от других биологических мембран.
Склерозы, аутоиммунные заболевания, связанные с разрушением миелиновой оболочки аксонов в некоторых нервах, приводит к нарушению координации и равновесия.
Энергетический обмен в нервной ткани. Значение аэробного распада глюкозы.
Головной мозг хорошо снабжается кровью и имеет интенсивный энергетический обмен. Хотя головной мозг составляет около 2% массы тела, при спокойном состоянии организма он утилизирует около 20% поглощенного кислорода и 60% глюкозы, которая полностью окисляется до СО2 и Н2О в цитратном цикле и путем гликолиза. В клетках головного мозга практически единственным источником энергии, который должен поступать постоянно, является глюкоза. Только при продолжительном голодании клетки начинают использовать дополнительный источник энергии - кетоновые тела (см. рис. 305). Запасы гликогена в клетках головного мозга незначительны. Жирные кислоты, которые в плазме крови транспортируются в виде комплекса с альбумином, не достигают клеток головного мозга из-за гематоэнцефалического барьера. Аминокислоты не могут служить источником энергии для синтеза АТФ (АТР), поскольку в нейронах отсутствует глюконеогенез. Зависимость головного мозга от глюкозы означает, что резкое падение уровня глюкозы в крови, например, в случае передозировки инсулина у диабетиков, может стать опасным для жизни. В клетках центральной нервной системы наиболее энергоемким процессом, потребляющим до 40% производимого АТФ, является функционирование транспортной Na+/К+-АТФ-азы (Na+/K+-«насоса») клеточных мембран. Активный транспорт ионов Na+ и К+ компенсирует постоянный поток ионов через ионные каналы. Кроме того, АТФ используется во многих биосинтетических реакциях.
Ацетилхолин (лат. Acetylcholinum ) - нейромедиатор, осуществляющий нервно-мышечную передачу, а также основной нейромедиатор в парасимпатической нервной системе. Четвертичное аммониевое основание. В организме очень быстро разрушается специализированным ферментом - ацетилхолинэстеразой.
Ацетилхолину принадлежит также важная роль как медиатор ЦНС. Он участвует в передаче импульсов в разных отделах мозга, при этом малые концентрации облегчают, а большие - тормозят синаптическую передачу. Изменения в обмене ацетилхолина могут привести к нарушению функций мозга. Недостаток его во многом определяет клиническую картину такого опасного нейродегенеративного заболевания, как болезнь Альцгеймера. Некоторыецентральнодействующие антагонисты ацетилхолина (см. Амизил) являются психотропными препаратами (см. также Атропин). Передозировка антагонистов ацетилхолина может вызвать нарушения высшей нервной деятельности (оказывать галлюциногенный эффект и др.).
Катехоламины - физиологически активные вещества, выполняющие роль химических посредников и «управляющих» молекул (медиаторов и нейрогормонов) в межклеточных взаимодействиях у животных и человека, в том числе в их мозге; производныепирокатехина. К катехоламинам относятся, в частности, такие нейромедиаторы, как адреналин, норадреналин, дофамин (допамин). Адреналин часто, особенно в западной литературе, называют «эпинефрин» (то есть «вещество надпочечников»). Соответственно, норадреналин ча сто называют «норэпинефрин».
Все высшие формы поведения человека связаны с нормальной жизнедеятельностью катехоламинергических клеток - нервных клеток, синтезирующих катехоламины и использующих их в качестве медиатора. От активности синтеза и выделения катехоламинов зависят такие сложные процессы, как запоминание и воспроизведение информации, сексуальное поведение, агрессивность и поисковая реакция, уровень настроения и активность в жизненной борьбе, скорость мышления, эмоциональность, уровень общего энергетического потенциала и т.д. Чем активнее идет синтез и выделение катехоламинов в количественном отношении, тем выше настроение, общий уровень активности, сексуальность, скорость мышления, да и просто работоспособность. Самый высокий уровень катехоламинов (на единицу массы тела) у детей. Дети отличаются от взрослых прежде всего очень высокой эмоциональностью и подвижностью, способность к быстрому переключению мышления с одного объекта на другой. У детей исключительно хорошая память, всегда хорошее настроение, высокая обучаемость и колоссальная работоспособность. С возрастом синтез катехоламинов как в центральной нервной системе, так и на периферии замедляется. Тому есть разные причины: это и старение клеточных мембран, и исчерпание генетических резервов, и общее снижение синтеза белка в организме. В результате снижения скорость мыслительных процессов, уменьшается эмоциональность, снижается настроение. С возрастом все эти явления усугубляются: снижается эмоциональность, настроение, нередки случаи депрессии. Причина этого в одном - в возрастном снижении синтеза катехоламинов в организме.
Высокое содержание в нервной системе дофамина усиливает все сексуальные рефлексы и повышает чувствительность клеток к половым гормонам, что способствует высокому анаболизму. Самым высоким содержанием дофамина в ЦНС отличаются подростки. Их настроение носит на себе налет эйфории, а поведение отличается выраженной гиперсексуальностью. Любые тренировки, даже неправильные с методической точки зрения, в подростковом возрасте дают хороший анаболический эффект. Возрастное падение содержания дофамина вызывает возрастную депрессию (снижение настроения), падение сексуальной активности (у мужчин) и замедление скорости анаболических реакций.
Катехоламины увеличивают нервно-мышечную проводимость, повышают быстроту реакции и скорость мышления. Даже поверхностное знакомство с обменом катехоламинов в организме помогает нам сделать вывод, что катехоламины являются ключевым звеном как в умственной, так и в физической работоспособности, как в скорости, так и в качестве мышления. Творческие способности, способность к абстрактному и художественному мышлению, к анализу и синтезу напрямую зависит от катехоламинового обмена.
Серотони́н , 5-гидрокситриптамин , 5-НТ - один из основных нейромедиаторов. По химическому строению серотонин относится к биогенным аминам, классу триптаминов.
Серотонин облегчает двигательную активность, благодаря усилению секреции субстанции Р в окончаниях сенсорных нейронов путем воздействия на ионотропные и метаботропные рецепторы.
Серотонин наряду с дофамином играет важную роль в механизмах гипоталамической регуляции гормональной функции гипофиза. Стимуляция серотонинергических путей, связывающих гипоталамус с гипофизом, вызывает увеличение секреции пролактина и некоторых других гормонов передней доли гипофиза - действие, противоположное эффектам стимуляции дофаминергических путей.
Серотонин также участвует в регуляции сосудистого тонуса.
γ-Аминомасляная кислота ,ГАМК, - аминокислота, важнейший тормозной нейромедиатор центральной нервной системы человека и млекопитающих.
γ-Аминомасляная кислота выполняет в организме функцию ингибирующего медиатора центральной нервной системы. Лиганды рецепторов ГАМК рассматриваются как потенциальные средства для лечения различных расстройств психики и центральной нервной системы, к которым относятся болезни Паркинсона и Альцгеймера, расстройства сна (бессонница, нарколепсия), эпилепсия.
Под влиянием ГАМК активируются также энергетические процессы мозга, повышается дыхательная активность тканей, улучшается утилизация мозгом глюкозы, улучшается кровоснабжение.
Глицин также является нейромедиаторной аминокислотой, проявляющей двоякое действие. Глициновые рецепторы имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга. Связываясь с рецепторами, глицин вызывает «тормозящее» воздействие на нейроны, уменьшают выделение из нейронов «возбуждающих» аминокислот, таких как глутаминовая кислота, и повышают выделение ГАМК. Также глицин связывается со специфическими участками NMDA-рецепторов и, таким образом, способствует передаче сигнала от возбуждающих нейротрансмиттеров глутамата и аспартата. В спинном мозге глицин приводит к торможению мотонейронов, что позволяет использовать глицин в неврологической практике для устранения повышенного мышечного тонуса.
Глутамат - наиболее распространенный возбуждающий нейротрансмиттер в нервной системе позвоночных. глутамат вовлечен в такие когнитивные функции, как обучение и память
Гистамин является одним из эндогенных факторов (медиаторов), участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда болезненных состояний.
В обычных условиях гистамин находится в организме преимущественно в связанном, неактивном состоянии. При различных патологических процессах (анафилактический шок, ожоги, обморожения, сенная лихорадка, крапивница и аллергические заболевания), а также при поступлении в организм некоторых химических веществ количество свободного гистамина увеличивается.
Свободный гистамин обладает высокой активностью: он вызывает спазм гладких мышц (включая мышцы бронхов), расширение капилляров и понижение артериального давления; застой крови в капиллярах и увеличение проницаемости их стенок; вызывает отёк окружающих тканей и сгущение крови..
Некоторые количества гистамина содержатся в ЦНС, где, как предполагают, он играет роль нейромедиатора (или нейромодулятора). Не исключено, что седативноедействие некоторых липофильных антагонистов гистамина (проникающих через гематоэнцефалический барьер противогистаминных препаратов, например,димедрола) связано с их блокирующим влиянием на центральные гистаминовые рецепторы.
|
Природа |
Действие |
|
|
мет-Энкефалин |
5 остатков аминокислот |
Кратковременное обезболивающее действие |
|
β-эндорфин |
30 остатков АК |
Морфиноподобные эффекты: обезболивание, возникновения чувства удовлетворения. снижение других эмоций. Важный периферический эффект:
|
|
γ-эндорфины |
Первые 17 остатков β-эндорфина |
Нейролептическое действие (торможение эмоциональной сферы). Обезболивающий эффект выражен слабо. |
|
α-эндорфин |
Первые 16 остатков β-эндорфина |
Психостимулирующее: стимуляция эмоций, увеличение моторной активности |
|
Природа |
Действие |
|
|
Вазопрессин |
Циклические нонапептиды |
Способствует формированию долгосрочной памяти |
|
Окситоцин |
Циклические нонапептиды |
Умеренно препятствует формированию долгосрочной памяти |
|
Холецисто-кинин-8 |
Декапептид |
Очень мощный ингибитор пищедобывательного поведения |
|
Нейротензин |
13 остатков АК |
Подобно анальгину, вызывает эффекты: обезболивающий (не через опиатные рецепторы), гипотермический и гипотензивный |
|
Эндозепин-6 |
Гексапептид |
Ингибирует ГАМКА - рецепторы. Вызывает беспокойство и проконфликтное поведение |
|
Пептид дельта сна |
Не входит ни в одно из 18 семейств |
Сильный снотворный эффект, облегчение стрессовых состояний |
Дубителей, например формалина. Приводимые ниже данные характеризуют поведение обработанных формалином коллагеновых волоконец, выделенных из сухожилий хвоста крысы. Все измерения проводились в водной среде , в условиях равновесия между набухшей аморфной и устойчивой спирально-упорядоченной кристаллической фазами (подробнее см. ).
В челюстно-лицевой хирургии в качестве матриц для прорастания тканей используют композиционные полимерные маты, содержащие углеродные и фторуглеродные волокна, а для армирования искусственных хрящей, имеющих гелеобразное строение - коллагеновые фибриллы.
При недостатке витамина С нарушается гидроксилирование остатков пролина, что затрудняет формирование коллагеновых фибрилл и волокон. В результате возникает системное поражение соединительной ткани.
Большая прочность и другие свойства коллагенов связаны с особенностями строения его молекул - тропоколлагенов. Каждая молекула коллагена состоит из трех полипептидных цепей , скрученных в виде трехжильного каната (рис. 91, а). Множество молекул коллагена объединяются в виде параллельных повторяющихся пучков, смещенных друг относительно друга , образуя коллагеновые фибриллы (рис. 91, б). Между отдельными фибриллами имеются поперечные водородные связи , благодаря чему образуются практически не растяжимые волокна (рис. 91, в). С возрастом у человека образуется все больше поперечных связей в коллагеновых во-
Строение молекулы коллагена (а), коллагеновых фибрилл (б), коллагеновых волокон соединительной ткани (в) и молекулы эластина (г)
II и III - фибриллярные коллагены. Это главные типы коллагенов, встречающихся в соединительных тканях , из них особенно широко распространен тип 1. Носле того как молекулы этих трех типов коллагена переходят из клеток в межклеточное пространство , они организуются в упорядоченные полимеры , называемые коллагеновыми фибриллами. Это тонкие (толщиной 10-300 нм) канатовидные структуры длиной во много микрометров, ясно видимые на электронных микрофотографиях (рис. 14-33). Эти фибриллы часто группируются в более крупные пучки толщиной в несколько микрометров, которые видны уже в обычный микроскоп как коллагеновые волокна . Молекулы коллагена типа IV
После того как коллагеновые фибриллы сформировались во внеклеточном пространстве , их прочность сильно возрастает благодаря
Коллагеновые фибриллы имеют разную толщину и по-разному организуются в различных тканях . Например, в коже млекопитающих они расположены наподобие прутьев в плетеных изделиях и поэтому сопротивляются нагрузкам по всем направлениям. В сухожилии они собраны в параллельные пучки , уложенные вдоль главной оси, а в зрелой костной ткани и роговице их расположение напоминает чередующиеся слои в фанере - фибриллы каждого слоя уложены параллельно друг другу почти под прямым углом к фибриллам соседних слоев. Так же организованы они и в коже головастика (рис. 14-39).
Организация коллагеновых фибрилл во внеклеточном матриксе приспособлена к потребностям ткани 499
Клетки могут участвовать в организации секретируемых ими коллагеновых фибрилл, изменяя натяжение матрикса 499
Коллагеновые фибриллы образуют продольные зигзагообразные структуры длиной чуть меньше 1 /4 длины тройной спирали. Между концом одной тройной спирали и началом следующей имеется пространство, которое может служить местом отложения кристаллов гидроксилапатита при образовании кости. Диаметр коллагеновых фибрилл колеблется от 10 до 100 нм, и под микроскопом они видны в виде пучков в экстрацеллюлярном матриксе соединительной ткани.
Микрофибриллы уложены в тетрагональную решетку , имеющую период 3,8 нм. Они образуют волокнистый элемент коллагена - коллагеновую фибриллу Диаметр этих фибрилл в зрелом возрасте колеблется в пределах 100-500 нм.
Коллагеновые фибриллы окружены межфибриллярной матрицей, состоящей в основном из мукополисахаридов и в меньшей мере - из структурных гликопротеинов . Эта структура распространяется в ширину, образуя элементы сухожилия диаметром в несколько сотен микрометров. Элементы сухожилия, соединяясь с упругими волокнами и фибробластами, образуют макроскопическое сухожилие.
Коллагеновые фибриллы образуют плоские гофрированные ленты разных размеров (рис. 2.64, б). Эти ленты являются основой макроскопического элемента сухожилия.
Наряду с описанными выше белками, выполняющими тонкие высокоспециализированные функции, существуют белки, имеющие в основном структурное значение. Они обеспечивают те или иные аспекты механической прочности и других механических свойств отдельных тканей живых организмов. В первую очередь следует сказать об уже упоминавшемся выше коллагене - основном белковом компоненте вне1спеточного матрикса соединительной ткани . У млекопитающих коллаген составляет до 25% От обп1ей массы белков . Коллаген синтезируется в фибробластах - основных клетках соединительной ткани . Как уже отмечалось выше, первоначально он образуется в виде проколлагена, предшественника, который проходит в фибробластах определенную химическую обработку, состоящую, в частности, в окислении ряда остатков пролина до гидроксипролина и некоторых остатков лизина до 6-гидроксилизина. Коллаген формируется в виде трех скрученных в спираль полипептидных цепей , которые уже вне фибробластов объединяются в коллагеновые фибриллы диамет]эом в несколько сотен нанометров, а последние - в уже видимые в световом микроскопе коллагеновые нити.
Коллаген представляет собой очень высокую организацию материи на всех ступенях развития своей структуры - от объединения аминокислот в нолипептидные цепи до разнообразнейшего переплетения коллагеновых фибрилл и волокон, которые мы наблюдаем в различных тканях
Проявление ранних (до 1 месяца) изменений в легких состоит в общетоксическом , аллергическом действии Б. в поздний период (до 12 месяцев) - гиалиноз коллагеновых фибрилл, прогрессирование склероза легких с образованием коллагеновых волокон, тяжелые деструктивные изменения паренхимы с нарушением в легких воздухообмена, развитие гипоксии и ги-поксемин. В легких в ранней стадии увеличивается содержание коллагеновых белков, о чем свидетельствует прирост окси-иролина, затем оно снижается, а к 9-13 месяцам опять резко возрастает.
После секреции пропептиды молекул нроколлагена типов 1. 11 и 111 разрушаются специфическими ферментами уже вне клетки, и проколлаген превращается в коллаген (называемый также тропоколлагеном. Образовавшиеся молекулы коллагена толщиной 1,5 нм объединяются во внеклеточном пространстве в значительно более крупные коллагеновые фибриллы (толщиной 10-300 нм). Фибриллы образуются частично за
| Рис. 14-38. Внутримолекулярные и межмолекулярные сшивки между модифицированными боковыми цепями лизина в коллагеновой фибрилле. Сшивки образуются в несколько этапов . Вначале некоторые остатки лизина и гидрокеилизина дезаминируются внеклеточным ферментом лизилоксидазой , и здесь появляются альдегидные группы , обладающие высокой реакционной способностью. Затем эти группы самопроизвольно реагируют с образованием ковалентных связей друг с другом или с другими остатками лизина или гидрокеилизина, так что в сшивке может участвовать более двух аминокислотных боковых цепей. Некоторые из образуемых связей относительно нестабильны и в конце концов модифицируются, превращаясь в разнообразные более стабильные сшивки. Обратите внимание, что большинство сшивок образуется межд> |
| Рис. 14-48. Базальная мембрана роговицы куриного эмбриона . Микрофотография, нолученная с помощью сканирующего электронного микроскопа . Часть эпителиальных клеток (Эп) была удалена, чтобы показать верхнюю поверхность базальной мембраны (БМ). Обратите внимание, что с нижней поверхностью мембраны взаимодействует густая сеть коллагеновых фибрилл (К). Макромолекулы базальной мембраны синтезируются лежащими на ней эпителиальными клетками . (С любезного разрешения Robert Trelstad) |